等温量热滴定（ITC）对样品的要求可以概括为“纯、清、准、齐、足、稳”六个关键字，具体细节如下：
纯度
• ≥90 %（HPLC 或 SDS-PAGE 判断）
• 杂质会贡献额外热量，导致基线漂移或假结合信号。
澄清度
• 必须无可见颗粒、无气泡、无沉淀；如有悬浮物，粒径须＜100 nm
• 实验前 12 000 g 离心 10 min 或用 0.22 µm 滤膜过滤，并真空脱气 5 min。
浓度准确性
• 样品池中“被滴定物”浓度误差直接影响计量比 n；滴定针中“配体”浓度误差直接影响 KD 和 ΔH。
• 如未知 KD，可先按经验配制：
– 蛋白（池）≈10–50 µM（≈10×KD）
– 小分子（针）≈100–1000 µM（≈10–20×池浓度）
• 建议用 A280、HPLC 或氨基酸分析法精确测定摩尔浓度。
缓冲液一致性（“齐”）
• 两样品必须用完全一致的缓冲体系，包括盐、辅因子、去垢剂、DMSO 等；最可靠的方法是把蛋白透析到最终缓冲液，再把小分子直接溶解在该透析液中。
• pH 差异应＜0.05 单位，DMSO 或甘油浓度差异＜1 %，否则会产生显著的稀释热背景。
• 谨慎使用还原剂：β-ME、DTT 易产生背景热；若必需，TCEP≤1 mM 是首选。
体积与消耗量（“足”）
• MicroCal 系列：
– 样品池 ≥280 µL（实际装 200 µL，需留死体积）
– 滴定针 ≥60–100 µL（40 µL 用于滴定，其余润洗、预滴）
• 若一次实验需做多条件对照，请按比例递增准备。
稳定性
• 样品在实验温度（2–80 ℃）下至少 1 h 内不沉淀、不降解、粘度不变。
• 对易聚集蛋白，可加入少量 Tween-20（≤0.05 %）或少量甘油（≤5 %）以提高稳定性，但需确保与滴定液一致。
常见“踩坑”提醒
强酸、强碱、有机溶剂过高（>5 % DMSO、乙醇）会腐蚀哈斯特镍合金池体或直接损坏仪器。
滴定过程中若出现大量沉淀或粘度突增，会导致搅拌异常、信号漂移，实验需终止。
实验前务必做“缓冲液-缓冲液”空白滴定，以验证体系匹配性并扣除稀释热。
一句话总结：把样品做成“澄清、纯净、精准、缓冲液完全一致”的溶液，并准备足够的体积，就能最大限度保证 ITC 实验成功率和数据可靠性。